英文名称 ：Duchenne muscular dystrophy

进行性假肥大性肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是最早被定位并克隆致病基因的单基因遗传病的代表性疾病，是有文献记载发现史已近200年的“古老疾病”，也是30年来在基因诊断、基因治疗领域引领潮流的“明星疾病”。

DMD又称迪谢内肌营养不良。以最先系统总结本病并提出诊断标准的法国神经病学家Guillaume Benjamin Amand Duchenne的姓氏命名。DMD是由编码抗肌萎缩蛋白的DMD基因的致病性突变造成肌萎缩蛋白功能完全丧失，无法维持肌膜在伸缩运动中的完整性，进而引起一系列病理生理改变，最终造成肌肉进行性无力萎缩的一种致残致死性疾病。贝克肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）是其轻症表型，因致病突变仅导致肌萎缩蛋白功能部分丧失，所以疾病进展较慢。

1830年，英国神经病学家Bell首次在其著作中描述了肌营养不良病例，并提出“muscular dystrophy”的病名。此后陆续有病例报道，如意大利医生Giovanni Semmola和Gaetano Conte分别在1934年和1936年报道了肌营养不良病例。1868年，Duchenne通过对13例DMD患者的总结，提出了本病的临床诊断标准。该诊断标准如下：①下肢起病的无力；②步基宽、步态呈腰椎前凸；③无力肌肉假肥大；④进行性加重；⑤疾病中晚期电刺激时肌肉收缩减弱；⑥无尿便障碍、感觉障碍及发热。值得一提的是，Duchenne在150年前已经将电生理检查和肌肉活检应用于DMD的诊断。这一诊断标准即使在今天，仍具有很高的临床应用价值。1886年，英国神经病学家Gowers在其著作中提出假说，认为DMD是与遗传相关的基因缺陷性疾病，并报道了迟发患者（可能是BMD患者）。1938年，北京协和医院神经科确诊了中国第一例有完整病历记录的假肥大性肌营养不良患者，包括肌肉活检报告等住院资料都完好保存至今。1955年，德国神经病学家Peter Emil Becker总结了一组与DMD症状类似，但病情较轻的X连锁遗传肌营养不良，此后以其姓氏命名为Becker肌营养不良（BMD）。

本节将介绍DMD在发现确立、诊断治疗等方面的进步历程和未来发展，也反映出整个单基因病诊治领域的趋势。

DMD遗传方式为X连锁隐性遗传，基因位于X染色体短臂近着丝粒的2区1带，体量巨大，全长约2.4Mb，含79个外显子。因特殊序列结构和基因大小，使其存在较高的新发突变风险，造成DMD较高的发病率。

1985年Kunkel团队首先将DMD致病基因定位于Xp21并进行了克隆。DMD是第一个（另一说法是与X连锁慢性肉芽肿病在相近时间被定位）定位致病基因的单基因遗传病，开启了单基因遗传病发现致病基因的先河，也为其他历史悠久的遗传性疾病的研究树立了典范。DMD的发病率在各个国家地区和人种间无明显差异，在活产男婴中为1/6 300～1/3 600。我国浙江省的新生儿筛查结果显示，中国人群DMD发病率为1/4 560。BMD发病率为DMD的1/5～1/4。

（一）现有治疗

确诊DMD/BMD后，目前药物治疗方面以长期口服肾上腺糖皮质激素类药物为核心，可在一定程度上延缓疾病进程。疾病管理方面，强调多学科团队（MDT）联合诊疗模式，针对疾病不同阶段涉及的器官系统综合治疗。同时，给予患者家庭遗传咨询，为再次生育做好产前诊断预防。

（二）基因治疗

虽然阻断下游病理生理机制可在一定程度上延缓病程，但对于基因缺陷性疾病，人们会顺理成章地想到通过修复基因缺陷，解决根本病因，恢复正常功能。为实现这一目标，就需要进行基因治疗。2018年，美国食品药品监督管理局（FDA）对基因治疗的最新定义为调整/操控基因表达或改变细胞生物学特性的治疗手段。这一定义较为宽泛，一般认为永久性改变细胞遗传物质DNA的治疗为狭义基因治疗；不改变DNA，通过其他方式调整基因功能和细胞生物学特性的治疗为广义基因治疗。作为基因缺陷性疾病的代表，DMD同样在基因治疗方面走在了前列。

1.外显子跳跃策略

经过前期临床试验，2016年治疗DMD的外显子51跳跃药物eteplirsen在美国被批准上市。在此之前的另一种药物drisapersen（同样为外显子51跳跃药物）因治疗效果不明显，曾被FDA拒绝批准。eteplirsen是具有特殊分子结构的反义寡核苷酸药物，针对DMD基因51号外显子的剪切区。其结合在mRNA前体上，干扰51号外显子的剪切，在拼接mRNA时不含51号外显子。对于外显子45至50缺失、外显子48至50缺失等缺陷类型的DMD患者，部分mRNA剪切时变为外显子45至51缺失、外显子48至51缺失，从而纠正读码框，生成截短肌萎缩蛋白。临床试验中可观察到治疗后的患者部分肌肉细胞膜上出现一定量肌萎缩蛋白。这一广义基因治疗药物的优点是制备流程接近传统小分子药物，产量和成本具有一定优势，而且不直接改变DNA，相对安全。近期的临床试验中通常采用30mg/kg每周静脉注射1次，持续24～96周，患者需在试验结束后长期用药。缺点是：①只适用于部分DMD患者，只有相应区段大片段缺失的患者能够应用外显子51跳跃药物，仅占DMD患者的13%。②对靶细胞没有选择性，到达作用靶点的药量有限，药物输送过程中有大量损耗和降解。③治疗作用弱、持续时间短。进入肌肉细胞内的反义寡核苷酸数量不多，与mRNA前体结合并发挥治疗作用后即被降解。即使重复给药，整体治疗效果仍然较弱。针对这些缺点，外显子跳跃治疗策略也在不断改进，措施包括：①利用相似原理，制备其他外显子跳跃药物，逐步扩大适用范围；②在寡核苷酸链上增加靶向肽，引导其更多进入目标细胞（骨骼肌、心肌细胞），增加治疗效果，减少副作用；③进一步改进反义寡核苷酸结构，增强稳定性，减少损耗，增加作用时间。反义寡核苷酸的RNA干扰作用在许多单基因病中均有应用，已有数种药物被批准上市，如治疗脊髓性肌萎缩症的诺西那生钠（nusinersen）、治疗家族性转甲状腺素蛋白淀粉样变的inotersen、patisiran。

2.无义突变跳读策略

DMD患者中无义突变约占10%，无义突变跳读也属于广义基因治疗范畴。早在1979年，科学家就发现氨基糖苷类抗生素能够跳读真核生物DNA无义突变造成的蛋白翻译提前终止，使蛋白翻译继续下去。而后在体外细胞系、动物模型及患者临床试验中均证实氨基糖苷类抗生素具有这一作用。但鉴于氨基糖苷类长期应用的肾毒性、耳毒性等副作用，亟须寻找其他具有无义突变跳读作用而副作用小的药物。经过大规模筛选，发现了PTC124这一小分子药物，并于2014年在欧盟有条件上市。然而由于其临床试验和上市后临床应用中显示的治疗效果微弱，始终未获得美国FDA批准。无义突变是广泛存在于各种功能失去突变（loss-of-function mutation）单基因病中的致病突变类型，以这种突变为治疗靶点的药物应用前景广阔。目前多家研发机构仍在积极筛选高效安全的无义突变跳读药物。

3.外源基因导入策略

DMD是典型的功能失去突变所致单基因病，如果能在体细胞中导入一个替代基因，转录翻译生成蛋白，发挥相应功能，就可能治愈疾病。通过何种载体，将所需基因导入目标细胞，是这一治疗策略的关键环节。目前备受关注的两类载体是非病毒载体和病毒载体。非病毒载体包括脂质体载体、纳米载体等，其制备较为简单，但靶向运送效率低。病毒载体则利用了病毒天然的靶向侵袭能力，能够高效地运输目标基因。但必须克服病毒载体自身的致病性、整合入宿主基因组等问题。经过数十年的摸索，腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）最终脱颖而出，成为目前主要的基因治疗载体。AAV主要有以下优点：①几乎无致病性，且通过重组改造完全去除了其基因组中用于扩增、传播的元件；②AAV基因组极少插入宿主基因组；③病毒颗粒小，可通过各种屏障，包括血脑屏障；④理化性质稳定，耐热耐酸碱，便于保存、运输；⑤有多种血清型，靶向不同细胞类型。当然AAV也并非完美，其缺点是：①载量有限，只有约4.7kb，无法完整装载像DMD这样的大基因；②制备流程复杂，产量低，花费高；③部分人群已存在针对某些血清型的天然抗体。尽管有这些缺点，AAV仍是目前的主流基因载体。目前由美国三家公司开展的基因导入治疗DMD临床试验均选择AAV为载体，以导入尽量保留功能的截短肌萎缩蛋白。从已公布的结果看，均已显示出疗效。此外，2017年12月美国FDA批准的治疗遗传性视网膜营养不良的RPE65基因导入和即将获批的治疗脊髓性肌萎缩症的SMN1基因导入，全部选用了AAV载体。

4.基因编辑策略

导入细胞的未整合外源基因无法随细胞分裂成倍复制并传入子代细胞，仅适用于寿命长的成熟细胞，如神经细胞、横纹肌细胞等，不适合快速更新换代的细胞组织，如血液系统、上皮组织等。如果能将外源基因整合入染色体，就能向子代传递。然而，不受控的基因插入很可能破坏原基因组，造成基因功能受损，引起肿瘤等疾病。这也是病毒感染引发肿瘤的重要机制。基因治疗希望能够实现定向、受控的基因编辑。基因编辑工具包括兆核酸酶（meganucleases）、锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和近年非常火热的成簇规律间隔短回文重复序列编辑系统（CRISPR-Cas9）。其中，CRISPR-Cas9能够很方便地设计指导RNA（gRNA）以定位目标片段进行切割等基因编辑，大大提高了效率。此外，由CRISPR-Cas9衍生的不断链单碱基编辑系统，包括腺嘌呤碱基编辑器（ABE）及胞嘧啶碱基编辑器（CBE），均被尝试用于DMD等单基因病的基因编辑治疗。当前基因编辑治疗方兴未艾、百花齐放，但我们也要清晰地看到，传统基因编辑工具特异性较高，但针对特定疾病设计，制备困难，成本高昂。以CRISPR-Cas9为代表的新型基因编辑工具可通过简单设计gRNA针对不同疾病，效率高，但特异性较低，会出现目标区域外的脱靶现象，而脱靶造成的影响尚不能估计，可能造成不可挽救的严重后果。因此，虽然在建立模型动物、体外诊断、细胞水平、动物实验水平已有很多应用，直接用于人体治疗仍然需慎之又慎。

5.干细胞治疗及其与基因治疗的结合

调控干细胞定向分化为所需组织类型，控制干细胞增殖过程中的癌变风险，消除干细胞与宿主间的免疫排斥，都是目前干细胞治疗需要解决的问题。干细胞治疗与基因疗法相结合也是重要的治疗方向。其治疗策略为：通过患者血液、皮肤或肌肉组织制备患者特异性诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）或定向分化干细胞，在体外（ex vivo）通过基因编辑工具进行基因缺陷修正，而后检测基因编辑是否准确纠正了原基因缺陷，是否出现严重脱靶破坏了原基因组，筛选出改造良好的细胞系回输患者体内，替代原有病变组织，最终治疗疾病。这一策略已经在小鼠动物模型中实现：利用取自基因缺陷小鼠模型的肌肉组织，体外培养获得肌肉干细胞（muscle stem cell，MuSC），通过基因编辑工具修正基因缺陷，再筛选改造良好的干细胞原位注射到小鼠肌肉组织中。这些干细胞分化为细胞膜含有肌萎缩蛋白的正常肌肉组织，发挥运动功能。

今后，这些基因治疗策略在单基因遗传病，甚至复杂疾病中都将会有广泛应用，必将开启基因治疗时代。