俗话说：百闻不如一见。在组织化学与细胞化学研究中，目的是将存在于组织或细胞中的待测物通过有色沉淀、荧光或高电子密度的物质显示出来，使看不见或分辨不清的待测物变为看得见、分得清。为长期保存研究结果、便于分析和交流，则需应用显微摄影技术将研究结果真实地记录下来。虽然摄影图像是一种二维平面图像，但是，其明暗、色彩、形状与被摄物具有一一对应关系，就像人们亲眼目睹一般，其逼真性通常不会使人们怀疑摄影的真实性。摄影作为媒介实现视觉信息的传达，摄影的功能在某些方面超越了文字和绘画，它比文字更具体和直观，比绘画更为精确。因此，一篇好的研究论文，无论是细胞水平，还是分子水平，甚至基因水平，越来越趋向于用好的图片来说话，以至于人们形成了看文章先看图片的习惯。“一图胜万言（A picture isworth ten thousand words）”说的就是这个道理。摄影术在其诞生之时就具有审美价值，对于注重“色彩”的组织化学与细胞化学则更不例外，尤其是多重免疫荧光标记与激光扫描共聚焦显微技术的应用，使免疫荧光技术迈进了一个“五彩缤纷”的科学艺术天地（图1）。研究者在镜头前的空间中创作与选择，使摄影既达到纪实的目的又有视觉艺术的效果。

图1体外培养分化的神经干细胞免疫荧光细胞化学染色

（美国威斯康星大学张素春供图）

显微摄影技术（photomicrography）是指利用显微照相装置，把显微镜下观察到的图像拍摄下来，制作成照片，或将图像信息传输、记录于其他仪器设备，以供进一步研究和分析。近年来，随着数码技术的日益提高和普及，克服了传统胶片显微摄影技术的不足，使显微摄影变得更为方便、高质量和高效。但利用数字影像处理软件对图像进行篡改、伪造的案例也时有发生，这种行为与科学伦理道德要求完全背道而驰。“真实”是显微摄影的目的和生命，在此前提下，如何获取高质量图像则取决于显微摄影技术水平。在科技高度发达的今天，尽管有很多先进的显微摄影设备相继问世，具有高性能、高自动化等特点。但是，显微摄影技术是一门综合技术，即使是相同的设备，并不一定能获得同样质量的图片，因此，除有先进设备外，熟练掌握显微摄影原理和技术是非常必要的。

显微摄影是通过显微镜的光学系统成像，拍摄对象千差万别，照明光源类型各不相同，在曝光技巧和感光材料的选择上，比一般的人物和风景摄影更为复杂。但显微摄影是摄影学的一个分支，其基本原理相同，方法也有相似之处。为能更好地学习显微摄影技术，有必要对摄影的基础知识作一般了解。

一、照相机镜头

镜头是照相机的关键部件，镜头的分辨率和色彩还原是鉴别镜头质量的重要标志之一。照相机的镜头由多片凸透镜和凹透镜与相应的金属零件组合而成。镜头的光学结构通常采用透镜片组表示（图2）。凸透镜有会聚光线的能力，凹透镜只能发散光线不能成像，它们相互作用，加强纳光性能，提高结像质量，减少相差。镜头之所以能成像是被摄物通过透镜聚成影像，当光线穿过透镜时，即向主轴折射，而后到达像屏上，会聚成影像，被摄物各个部分的位置和原物体完全相反，即上下颠倒，左右相反。

图2透镜片组

（一）镜头的焦距

镜头的焦距（focal length）是从镜头的中心点至感光胶片平面的距离，理论上是指当镜头对准无限远的景物并清晰成像时，镜头像方主面至胶片之间的距离。焦距用F表示，如50mm焦距的镜头，其标志为F=50。镜头的焦距决定该镜头拍摄的物体在胶片上所形成影像的大小，当物距不变时，镜头的焦距越长，被拍摄物体在胶片上所形成的影像就越大。

（二）镜头的有效孔径

在照相机镜头安装有用于控制光线通过的孔径光阑，俗称光圈（aperture）。改变光圈的大小，可以改变镜头的通光孔径。因此，镜头的孔径可以理解为镜头光圈的开口直径，其大小与镜头的通光量成正比，孔径大，通光量多，反之，通光量少。然而，镜头的通光量还与镜头的焦距有关，焦距越长，相对通光量越少，故镜头的孔径常指其相对孔径，即通过镜头的光束直径与焦距的比值，也称光圈系数（f系数），常标刻在镜头壳侧面。但镜头的相对孔径并非其有效孔径（effective aperture）。有效孔径也称镜头口径，即镜头的最大光圈，是表示镜头最大进光量的参数，其大小与镜头的最大直径和焦距有关，以镜头最大光孔直径（光圈开到最大时）与焦距的比值表示。如50mm焦距的镜头最大光孔直径是25mm时，其比值为1:2，该镜头的有效孔径或最大光圈为f2；当最大光孔直径为35mm时，比值为1:1.4，则其有效孔径或最大光圈为f1.4。由此可见，最大f系数越小，表示镜头口径越大。口径较大的镜头，使用起来较方便，如可以在较暗的光线下快速曝光。

（三）镜头的视角

人眼所能覆盖的视野范围称为视场。对照相机镜头而言，其前方被摄景物在胶片位置上所能结成的可见圆形影像的范围，称为镜头的像场。像场周围边缘与镜头像方主点形成的夹角称为镜头的像角，像场所对应的景物范围称为视场，视场边缘与镜头物方主点所形成的夹角称为视角。通常视角与像角相等，在0°～180°范围内。

镜头成像时，通常在像场中心及接近中心的影像清晰明亮，边缘部分的影像模糊灰暗。像场范围内最清晰的部分称为有效像场，也称镜头的照盖率。拍摄时，应选取有效像场作为曝光区域。有效像场通常为长方形，其大小与胶片大小一致。有效像场的像角分为3种，即水平像角、垂直像角和对角线像角。通常所说的镜头视角实际上是指镜头的对角线像角。

一般，相机胶片的大小是固定的，因此，视角大小由镜头的焦距长度所决定，焦距越短，视角越大，反之，视角越小（图3）。

图3不同焦距镜头的视角

（四）景深与焦深

1. 景深

景深（depth of field）是指拍摄对象的最近清晰点至最远清晰点之间的范围。人们通常理解只要对被摄物体聚焦，即可拍摄，实际上在被摄物体周围还有一个清晰范围，并且这个清晰范围的大小是由摄影者控制，而对景深的控制是摄影作品成败的重要因素之一。被摄物前的一段清晰范围，称前景深；被摄物后的一段清晰范围，称后景深；从前景深到后景深总称为景深。一般来说，某一物体只能在一定的像点上形成清晰的影像。当对着被摄物体调焦，使其正好落在胶片上，这时的被拍摄物体成像是最清晰的。被拍摄物体的前后一定距离内的景物在胶片上的成像不是清晰的点，而是一个扩大的圆，称为弥散圆。如果弥散圆的直径小于人眼的鉴别能力，在一定范围内实际影像产生的模糊便不能分辨。这个不能分辨的弥散圆称为容许弥散圆（图4）。如果弥散圆的直径小于0.1mm，人眼便不能分辨其是一个点还是一个圆。这就是景深产生的原因。

图4景深与焦深示意图

景深与光圈大小、镜头焦距长短和镜头与被摄物体间距离（物距）有关，三者相互配合方能达到拍摄所需要的景深。

（1）光圈大小：在镜头焦距和被摄物体距离一定时，光圈越小，景深越大，光圈越大，景深越小。如图14-4所示，当光圈从f=2.8缩小到f=8时，与允许弥散圆相对应的焦深前后伸长，与之相对应的景深也相应变大。拍摄时，如果为了突出主题，使被拍摄物前后景深变小，可选择较大的光圈，如要景物清晰的纵深度较大，则选择较小的光圈。无论在一般摄影和显微摄影中，此原理应用甚广。

（2）镜头焦距：在光圈与被拍摄物体距离一定时，镜头的焦距越短，景深越大，焦距越长，景深越小。如要使主体突出、虚化背景，应选择长焦镜头，而要拍摄宏大场景，应选择短焦镜头。

（3）物距：在光圈和镜头焦距一定时，物距的变化与景深的变化成正比，物距越远，景深越大，物距越近，景深越小。为了获得较大的景深，可使相机离被拍摄物体远一些。

2. 焦深

焦深（depth of focus）是指在保持影像较为清晰的前提下，焦平面沿着光轴所允许移动的距离，即像平面两边的清晰范围（图4）。焦深大，可以清楚地观察到被拍摄物体的全层，而焦深小，则只能看到被拍摄物体的一薄层。焦深的大小与物镜的数值孔径、总放大倍数、光圈、拍摄距离和焦距有关：焦深与物镜的数值孔径、总放大倍数、光圈大小和拍摄距离均成反比，而与镜头焦距成正比。

（五）镜头的种类

根据照相机镜头的焦距长短及其与胶片画幅的对角线长度的关系不同，通常将镜头分为标准镜头、广角镜头、远摄镜头、中焦镜头等。

1. 标准镜头

标准镜头是指镜头的水平视角约与人眼的视角相等（50°左右），焦距约等于拍摄胶片画幅对角线的长度。拍摄胶片越大，产生覆盖“标准”视场的影像所需镜头的焦距越长。换言之，底片大小不同，使产生覆盖胶片的影像所需的镜头焦距也不同。如60mm×60mm的胶片对角线长度约为80mm，因此，焦距为80mm的镜头是该胶片的标准镜头；而24mm×36mm的胶片（135胶片），标准镜头的焦距为50mm左右，依此类推。因标准镜头的视场角度与人眼所看到的景物视场角度大致相同，因此所拍摄图像具有真实感。

2. 广角镜头

焦距短于胶片对角线的镜头称为广角镜头或短焦距镜头，其焦距比标准镜头焦距短，视场角度大。135相机广角镜头的焦距一般为17～35mm，焦距越短，视角越大（见图3），并且景深也随之增大。

3. 远摄镜头

远摄镜头又称长焦距镜头，是指焦距长于底片对角线的焦距镜头。以135相机为例，焦距在200mm以上，视角在8°以下（见图3），这类镜头在拍摄距离较远而又不易靠近被摄物的情况下非常有用。

4. 中焦距镜头

中焦距镜头又称“肖像镜头”，焦距在80～135mm。小于85mm的镜头拍摄肖像容易变形，而大于135mm的镜头拍摄肖像容易产生面部扁平。只有用中焦距镜头拍摄时，拍摄对象才逼真和自然。

二、感光胶片

感光胶片（film）的主要功能是通过相机的光学镜头，把拍摄的景物在感光乳胶上记录下来。感光乳剂随着光线的强弱发生不同变化而产生“潜影”，再通过冲洗，潜影就转变为可见的影像。感光乳剂是胶片成分中唯一具有感光作用的物质，乳剂的主要成分是卤化银和明胶，其中的卤化银，又称银盐，包括溴化银、氯化银和碘化银，其中溴化银的感光性较强，碘化银的感光性较弱，氯化银介于二者之间。银盐受到光照后还原为银颗粒，在胶片上产生潜影。感光胶片分为黑白和彩色两种。二者在感光原理上基本相同，都是因为乳剂层中的卤化银颗粒的感光性能而捕捉光信号，不同的是，黑白胶片最后形成的影像由金属银构成，而彩色胶片上最后形成的影像由染料组成。

（一）黑白感光胶片

黑白感光胶片是将被摄物体的色彩以不同的影调，即从白到黑的不同色阶（不同亮度和颜色深度）记录下来的感光材料，其乳剂层仅含一层由卤化银、明胶、光学增感染料等组成的感光乳剂。

1. 感光度

感光度（sensitivity）是指胶片的感光速度，即胶片对光线照射时反应能力的强弱。感光度与它所需要的曝光量成反比，感光度愈高，需要的曝光量愈少。感光度的高低主要取决于胶片乳剂的制备和加工工艺，一般情况下，卤化银颗粒越大，对光线的吸收能力越强，感光度越高；反之，卤化银颗粒越小，对光线的吸收能力越弱，感光度越低。因此，在光线较弱的环境下拍摄，常使用快速胶片，但是，感光度高的胶片产生的影像颗粒较大，质感欠细腻和所记录的色调等级多，反差小；而慢速胶片产生的影像颗粒要比快速胶片产生的更细，反差也相对较大，因而所形成的影像质感细腻，深受摄影爱好者的青睐。

目前常用的感光度表示方法有：德国的“DIN制”、美国的“ASA制”和中国的“GB制”，其中“GB制”与“DIN制”表示的感光度数值相同。1980年开始实行国际标准感光度，以ASA和DIN为基础，符号为ISO，表示方法：ISO 100/21°、ISO 200/24°、 ISO 400/27°。通常使用较多的是ISO 100/21°。

2. 感色性

感色性（color sensitivity）是指胶片对各种光波的敏感程度和敏感范围。胶片上感光乳剂成分不同，对不同颜色光的感受也不同。通常卤化银只能感受光波中波长较短的蓝光和紫外光，对波长较长的绿、黄、橙、红等颜色的光不敏感。如在乳剂层中加入相应的增感剂，则可增加胶片的感色范围。根据乳剂层感受光波的性质，黑白胶片可分为色盲片、正色片、全色片、红外片等。

（1）色盲片：色盲片乳剂层中不含增感剂，只能感受蓝光和紫外光，对黄绿光敏感性低，不感受红橙光。其特点是反差极大，影调明朗，灰雾度小，颗粒细，感光度低，在8°左右，可在暗红色灯光下进行冲洗加工。色盲片一般用于翻拍文件、黑白照片翻拍和印制电影拷贝（黑白电影正片）。

（2）正色片：正色片也称分色片，不但能感受蓝紫光，对黄绿光也有感受能力，但对红橙光仍不敏感，感光度在14°左右。其特点是颗粒细、清晰度高、反差低，一般用作翻拍拷贝的中间片及拍摄人像和黄绿色偏多的自然风光。

（3）全色片：全色片是指乳剂层中加入各种颜色的增感剂、可感受所有波长光线的黑白胶片。这种胶片能正确反映各种颜色的亮度层次，其敏感性与人眼大致相同，在冲洗等操作时必须在全黑的环境中进行，是普通摄影最常用的胶片。其特点是感光度高（18°以上），反差较低，影调柔和。将其装入相机进行拍摄及冲洗加工后，在胶片上得到与景物明暗相反的负像，成为印像用的底片，因此也称负片。

（4）红外片：是一种对红外光谱敏感的特殊胶片，能产生与全色片截然不同的特殊影像效果。

（二）彩色感光片

彩色感光片的感光乳剂层分为上、中、下三层，每层中除了卤化银以外，还加入了不同的增感剂和成色剂，就像人眼视网膜上有分别感受蓝色、绿色和红色的感光细胞一样，因此可以辨别各种颜色。其中上层乳剂是未加增感剂的色盲乳剂，只对蓝色光敏感，对绿色和红色光不敏感；中层乳剂加入了对550nm波长光线敏感的增感剂，因此中层乳剂对蓝色和绿色光敏感；下层乳剂中加入了对650nm光线敏感的增感剂，所以对蓝色和红色光均敏感。为了防止蓝光对中层和下层乳剂的感光，在上层乳剂和中层乳剂之间涂布一层黄绿光层，以吸收蓝色光。上、中、下三层感光乳剂层中不同生色剂的存在，使彩色感光片感光后分别生成所感受光的互补色，即上层生成黄色影像，中层生成品红色影像，下层生成绿色影像。三层不同颜色的影像叠合便生成彩色影像。彩色感光片按成像原理可分为彩色负片、彩色正片和彩色反转片。

1. 彩色负片

这种感光材料经过拍摄及感光所得到的是与原景物相反的负像彩色底片，需要通过彩色相纸的洗印才能获得与原景物相同的彩色影像。由于它有相对较高的曝光宽容度，价格便宜，所以成为胶片使用率最高的一种。其感光乳剂层的结构是上层为感蓝层，中层为感绿层，底层为感红层，上层与中层之间有一黄色的滤色层，用以滤去蓝光，以避免蓝光对中、底层的干扰。高感光度彩色负片中感绿层和感红层都是由二三层感光度不同的乳剂层组成。彩色负片在拍摄曝光后三层感光乳剂分别对蓝光、绿光和红光感光，经彩色显影后生成复像，再经漂白、定影后得到彩色的负像，即原景物中的彩色分别表现为其互补的颜色。

2. 彩色正片

彩色正片是用于获得正像的彩色感光片，其感光乳剂层的结构是上层为感绿层，中层为感红层，下层为感蓝层。彩色正片通过负像进行曝光，再经过彩色显影使已曝光的部位被显影，最后经过漂白和定影即得到彩色正像。彩色正片具有反差较高、颗粒较细和清晰度高的特点。

3. 彩色反转片

彩色反转片又称正像底片，其结构与彩色负片相似，经拍摄曝光后，先经首次显影（黑白显影）使曝光部位形成银像，再将胶片进行均匀曝光，并将未成银像的部位进行彩色显影，最后将银像全部除去，便可得到与原景物彩色相一致的图像。其主要用途有两种，一是制成幻灯片，二是印刷制版。在用作印刷制版方面明显优于其他胶片，从画面的影像清晰度，色彩还原及细腻的程度上均有突出表现。但是，彩色反转片的曝光宽容度和对光源的色温要求较高，所以要求曝光数值非常准确。

三、反差

观察一幅照片时总能看到不同层次的深浅变化，照片中不同部分的明暗差别程度称为反差，明暗对比强烈，则反差大，反之，则反差小。影响照片反差的因素首先是被摄物本身，被摄物各部分的亮度差与色彩饱和度直接影响反差的大小。在彩色对比中，黑白相邻、红绿相邻，蓝黄相邻等等，对比色相邻时，只要它们的明度相等，它们的反差最高，使人感到对比强烈和鲜明。其次，如前所述，胶片感光度的高低、光圈和镜头焦距也会影响反差的强弱。

四、曝光控制

欲得到一幅理想照片，使胶片正确曝光是其关键。影响胶片曝光的因素有三个：即镜头光圈、快门速度和胶片感光度。这三个控制因素的组合决定曝光正确与否。前两者决定照射到胶片的光线多少，后者决定胶片对光的反应速度。

（一）光圈

图5光圈系数与光孔大小

光圈由若干金属薄片组成，安装在镜头内部，可均匀地自由开合，以调节镜头的相对口径，控制进光量，这是光圈的主要作用，光圈缩小，相对口径也随之缩小；光圈开大，相对口径也随之开大（图5）。一般多数相机光圈系数采用数值f1.4、f2、f2.8、f4、f5.6、f8、f11、f16、f22、f32等。数字越大，光圈越小，对于上述光圈数值，可用“2n”次方计算任何两档光圈进光照度的倍率关系，n为两档光圈之间相差的档数，例如：f2与f8相差4档，2⁴=16，即f2的进光照度是f8的16倍。光圈的第二个作用是调节景深，光圈小时景深长，光圈大时景深短。光圈的第三个作用是调节焦深，即焦点的深度。光圈的第四个作用是调节反差，光圈大，反差小，光圈小，反差大。光圈的第五个作用是调节分辨力。分辨力除由镜头本身质量决定外，还受光圈大小的影响，每只镜头均有其最佳光圈，使用最佳光圈时，镜头的分辨率和影像反差均处于最佳状态。一般来说，把镜头的最大光圈收缩三档，则是该镜头的最佳光圈。如一只最大光圈是f2的镜头，收缩三档，最佳光圈为f5.6。

（二）快门

快门（shutter）是光圈的开启时间，用来控制感光片曝光时间长短的装置。快门的速度标记常见的有1、2、4、8、15、30、60、125、250、500、1000等，这些数字均是表示实际快门速度的倒数秒。快门开启时间长短与曝光量的多少成正比，如1/50秒比1/100秒时间长一倍，曝光量也多一倍。

从曝光均匀这一意义上来讲，用小光圈慢速度，比用大光圈快速度为好。从快门本身性质来讲，也是慢速度比快速度好，一般认为比较理想的快门速度为1/60～1/100秒。

由于光圈和快门是控制曝光的主要因素，因此两者的关系显得尤为重要。每档光圈系数（f系数）或快门速度都是其相邻的f系数或快门速度的光量的两倍或一半，如f11是f8通过光量的一半，但又是f16的两倍；1/60秒的快门速度是1/30秒光照时间的一半，但又是1/125秒的两倍。因此，f系数和快门速度之间存在一种倒易律关系。如果快门速度降低（即允许更多光线照到胶片上），光圈必须缩小（即让少量光线照到胶片上），才能获得等量的曝光。下面的f系数与快门速度的组合会产生完全相同的胶片曝光量：f16，1/30；f11，1/60；f8，1/125；f5.6，1/250；f4，1/500。若使用这五组不同的曝光组合拍摄，可以获得五张曝光相同的底片。如何选择一组光圈和快门速度组合呢？这要根据不同照片的需要进行，如果需要获得较大的景深，可选用较小的光圈，但是要承担影像模糊的风险，如果要凝结运动物体的动作，选用较高的快门速度，但要牺牲一些景深。

（三）胶片的感光度

胶片的感光度也像光圈和快门一样影响曝光，高感光度胶片，即快速胶片比慢速胶片对光更敏感，所以需选用较小的光圈或较高的快门速度。

五、色温

色温是指色质，即白光的程度（所谓白光就是日光、灯光、天空光等等）。讲色温时，常常把铁块的加热过程作为例子，就是说，将铁块加热时，它的颜色由红→橙→黄→白→青白色。铁块发热发光的过程所引起的光色质的变化是以色温来标志的，最初发热时色温低，呈青白色时色温高。英国物理学家Kelvin最早发现，他将黑体以绝对温度-273℃时开始加热，随着温度增高而开始出现色光变化。为了纪念Kelvin，把这种变化单位以他的名字命名，即Kelvin，而把-273℃称为Kelvin 0°，写作0°K，以后增加1℃，便称为1°K，1967年以后，将°K改为K。

色温的概念有两点应该注意：第一，光源的色温与光源的实际温度无关。例如钨丝灯的色温是3200K，如果在光源前面加一个橘黄滤色镜，它的色温就可降低到2500K。第二，色温这一概念只适用于符合“黑体”发光规律的色光，即从红到青白这一光系，只适用于白光，而不能用色温来表示绿光、紫光或品红光等。色温计只能测白光，而不能测色光。

胶片有日光型和灯光型之分，日光型胶片适合于5400K的色温下拍照，色温宽容度为±1200K，而灯光型胶片适合于3200K下拍照，色温宽容度为±700K。如果使用日光型胶片在灯光下拍摄（不加滤镜），冲洗出来的照片出现暖黄色，其原因是胶卷所要求的色温与拍摄光源的色温不平衡所致。一般情况下，日光片在日出后，日落前两小时至午间均为色温宽容度范围之内。如果使用日光片在显微镜的钨丝灯光下拍照，需加青蓝色滤色镜提高色温，以获得色温平衡。色温高时，拍摄的照片偏蓝色，色温低其照片偏黄橙色。

六、滤色镜的应用

滤色镜是摄影中常用的附件，它对光波可以进行选择性吸收、透射处理。在讲述滤色镜之前，需对原色光、补色光等概念作一般了解。

（一）原色光和补色光

白色光是由红色光、绿色光和蓝色光三种光等量混合而成。我们所见到所有景物的色彩均是它们对红、绿、蓝三色光的透射、反射和吸收造成的。所以，红、绿、蓝是一切色光的基本色光，简称三原色（图6A）。在三原色中，两个相邻色等量混合得出一个新的颜色，称为补色，即：红加绿等于黄；蓝加绿等于青；红加蓝等于品红；同样，两个补色相混合，得出一个原色，即：黄加品红等于红；黄加青等于绿；品红加青等于蓝。由两种色光相加能够产生白光，这两种色光称之为互补色（图6B）。互补的两色光之间对比强烈，色反差大。绿光加品红光等于白光即：绿与品红互为补色；黄与蓝互为补色；红与青互为补色。

（二）滤色镜的特性

1. 吸收特性

滤色镜能吸收滤色镜的补色，也就是说，滤色镜的补色不能通过。

2. 限制特性

图6加色光效应（A）和减色光效应（B）

滤色镜限制一部分色光通过，被限制的是它补色的临界色和间色。比如红色滤色镜，全部吸收青色，使它在底片上密度最小，而对蓝色和绿色则有所控制，在底片上稍有密度。

3. 通过特性

滤色镜能通过与滤色镜相同的色光。

由于各种滤色镜深浅不一样，其阻光率也有差别。一般浅滤色镜均有阻止和限制紫外线的作用，但能让其他光均匀地通过。

（三）滤色镜在摄影中的应用

1. 校正色调

利用滤色镜吸收、通过和限制三种特性，可对色调进行校正，使摄影效果更符合人眼的视觉习惯与经验，这是使用滤色镜的一个重要目的。不同颜色的景物其色调可能相近或相同，如黄色景物和蓝色景物在全色黑白胶片上形成的影像，其色调相近，这样就会造成两种颜色的景物色调类似，反差较小。如果加上黄色滤色镜，则可使黄色景物显得明亮、突出。

2. 调整反差

利用三原色对比和互补色对比，加强色彩的饱和度，以增加反差。如所拍摄的景物有红绿等不同颜色时，可选用红色滤色镜突出红色部分，使红与绿的反差增大；反之，要加强绿色部分，就要加用绿色滤色镜。

3. 消除或突出某种颜色

使用滤色镜有两种方法：其一是使用间色的滤色镜，如蓝、红两色的HE染色标本，可用紫色滤色镜使两色兼顾；其二是采用两次曝光，先用蓝色滤色镜做一次曝光，再用红色滤色镜做一次曝光，这样两者均得到了充分显现。

4. 校正色温

如果由于光的色温与底片的性能不相符，则要加用滤色镜进行校正，使光源色温与感光片性质相适应。用于此用途的滤色镜，即补偿滤色镜或称转换滤光器。如用日光片在灯光下拍照，需加青蓝色滤色镜。如灯光片在日光下拍照，需加橘黄滤色镜。加校正滤色镜以后，要根据滤色镜的密度适当增加曝光时间。

显微摄影利用显微镜照明光源发射的入射光束，经聚光镜聚焦于被观察标本上，带有标本信息的光线进入物镜，在物镜的焦平面上形成放大的物像，然后经过照相目镜对物镜形成的物像再放大和聚焦，最终投射到相机内的感光材料上。根据使用显微镜或研究目的不同，显微摄影可分为普通显微摄影和特殊显微摄影，后者包括利用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、相差显微镜、微分干涉相差显微镜等进行的显微摄影。一台高性能的显微镜往往可以将多种功能整合在一起，可进行固定细胞、活细胞或组织等多种形式的摄影。根据记录媒介（感光材料）的不同，显微摄影分为传统显微摄影和数码显微摄影两大类，传统显微摄影以感光胶片作为记录媒介，数码显微摄影用影像传感器和磁盘接收和记录影像。本节介绍传统显微摄影的特点和基本方法。

一、物镜和目镜的选用

显微摄影是以接物镜和接目镜作为摄影镜头，其中接物镜尤为重要，物镜的分辨率就是显微镜的分辨率。目镜与显微镜的分辨率无关，它只有把物镜已放大的影像进一步放大，即使是最好的目镜，也无法观察到未被物镜分辨的细节。所以摄影时，物镜要严格选择，不可任意滥用。

（一）物镜的选用

物镜种类繁多，光学性能相差悬殊，绝非任一物镜皆可产生最佳影像，摄影时必须选用得当。分辨率是影响物镜成像质量最重要的因素，因此选择物镜要以其分辨率为首选指标。数值孔径的大小决定物镜分辨率的高低，数值孔径越大，分辨率越高。但数值孔径大的物镜，特别是倍数≥40×的物镜，其景深范围较小。当拍摄的标本厚度超过物镜的景深范围时，就不能拍摄到标本全层都清晰的照片。在这种情况下，换用数值孔径略小或倍数稍低的物镜或选用带光阑调节的物镜（暗场、荧光）可增加景深，提高影像的清晰度。因此，数值孔径适中的物镜可提高显微图像的综合质量。

复消色差物镜能将可见光谱中的红、蓝和黄光聚焦于一点，改善红、蓝色光的球差和其他像差；倍数愈高物镜的像场弯曲愈显著，平场物镜校正了像场弯曲，不存在视野中心与边缘不同时准焦的现象。因此，为提高影像质量，消除像差和色差，应尽量选用平场复消色差物镜。在焦距和数值孔径相同时，油物镜的像差校正比干燥物镜完善，成像质量好。由于浸没油的折射率大于空气的折射率，从而提高了物镜的分辨率。同时，这层介质可使入射物镜的光线提高，提高视野亮度。采用油浸物镜还可消除物镜前端透镜表面的杂乱反射光，减少有害的反射光量，使物体影像反差增加。63×的中倍油浸物镜成像质量最佳，非常适于显微摄影。

（二）目镜的选用

目镜亦参与成像，它把物镜映来的影像进一步放大，并校正物镜余下的像差和色差。目镜种类多，光学性能差异较大，一定类型的物镜必须选用一定类型的目镜相互组合。附有摄影装置的显微镜，备有摄影目镜。这种目镜能较好地校正像场弯曲，提高成像质量。在物镜的有效放大倍率内，尽量优选低倍摄影目镜。

（三）物镜与目镜组合

在选择物镜和目镜时，除了考虑物镜的数值孔径和放大倍数，以及目镜的放大倍数外，更要考虑涉及有效放大率、分辨率、焦点深度和视野宽度等几个与摄影质量相关的问题。

1. 有效放大率与分辨率

显微镜的有效放大率是所用物镜数值孔径的500～1000倍。例如，使用数值孔径为0.65的40×物镜，其有效的放大倍数为325～650倍。为达此倍数，要选用8～16倍的目镜。高于16×目镜所得放大倍数叫做“空的放大”，对影像细节的分辨，没有丝毫提高。目镜倍数太低，总放大倍数太小，物镜分辨率不能充分发挥，本来可以辨认的细节，由于总倍数太小，挤在一起难以分辨。在这里要考虑物镜的数值孔径，不是总放大率，单纯考虑放大倍数，不顾及分辨率，就会出现摄影质量相差悬殊的结果。例如，用100/1.25物镜与4×目镜组合，总放大倍数为400倍，分辨距离为0.27μm；使用40/0.65的物镜与10×目镜组合，总放大倍数也是400倍，分辨距离下降到0.5μm。尽管总放大倍数相同，物像微细结构的分辨力几乎相差一倍。

2. 焦深和视野宽度

焦深与物镜的数值孔径和总放大倍数成反比。数值孔径小，放大倍数低的物镜和目镜，焦深长，只有选用数值孔径小和放大倍数低的物镜和目镜，加长焦深，才能把处于不同水平层次的结构清晰地摄入同一张底片内。

视野宽度与显微镜的总放大率成反比，使用高倍物镜和目镜，视野缩小。改用低倍物镜或目镜，降低总放大率，可增大视野。

二、光路合轴

显微摄影采用中心亮视野透射照明法，照明光束中轴与显微镜的光轴应在一直线上。摄影前，要对光路进行合轴调整。光路系统中的目镜、物镜和孔径光阑位于固定位置，无需调整，仅聚光器可变。因此，光路的合轴，实为聚光器的调中。聚光器的调中步骤如下：

（1）转动聚光器升降旋钮，把聚光器升至最高位置。

（2）接通光源灯的电源开关。

（3）将待拍摄标本放在载物台上，用4倍物镜聚焦。

（4）缩小镜座上的视场光阑，在视野中可见边缘模糊的视场光阑图像。

（5）微降聚光器，至视场光阑的图像清晰聚焦。

（6）用聚光器两个调中螺杆推动聚光器，将缩小的视场光阑图像调至视野中心。

（7）开放视场光阑，使多角形周边与视野边缘相接。

（8）反复缩放视场光阑数次，确认光阑中心和边缘与视野完全重合。

（9）使聚光器恢复顶点位置。

三、光阑调节

显微镜有两种可变光阑，孔径光阑和视场光阑。正确调整和使用光阑是保证摄影质量的重要环节。

（一）孔径光阑的调节

孔径光阑与聚光镜是构成聚光器的两个重要部分。显微镜的性能主要决定于物镜的性能，而物镜的性能又决定于数值孔径。物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关，两者孔径相等时，物镜分辨力最高。聚光镜的数值孔径受孔径光阑控制，用孔径光阑的开放与收缩，调节聚光镜数值孔径的大小。

显微摄影不同于一般摄影，其最大的区别是影像反差和景深小。影像反差和景深可随孔径光阑缩小而提高。孔径光阑小于物镜的数值孔径时，物像的分辨率和亮度降低，但影像反差和景深提高，影像更加清晰。所以，在不过多地降低分辨率的前提下，把孔径光阑调到所用物镜数值孔径的60%～80%大小比较合适。例如，物镜的数值孔径为1.0，孔径光阑的数值应调到0.6～0.7，所以，显微摄影时，缩小孔径光阑，尽管丧失少许的分辨力，却提高了影像反差、景深深度和影像的清晰度。

孔径光阑的调节方法：当聚光器标有孔径数字刻度时，根据物镜的数值孔径调节至所需的值即可。如果孔径光阑无数字刻度，在标本聚焦后，取下目镜，在物镜的后透镜中可见孔径光阑影像。光阑缩小时，仅见一亮点，逐渐开大光阑，亮孔扩大，直至需要的程度。当光阑缩小，视野亮度降低时，可适当提高电压增加照明强度。

在调节聚光镜孔径光阑之后，还应将聚光镜上下移动，同时注意标本上的光斑投影像。当光斑为最小最亮时，聚光镜即处于最佳聚焦位置，此时的显微图像亮度最大，分辨率最高，但此时的图像反差并非最佳，尤其对于未染色或染色浅淡的标本，会使观察者的眼睛难于分辨其微细结构。在这种情况下，若将聚光镜略微下降，会使图像反差有所改善。在使用10倍以下低倍物镜进行拍摄时，应将聚光镜系统中上方的小聚光镜移出光路，以免照明视野过小而使视野四周出现暗角。

（二）视场光阑的调节

视场光阑位于镜座之中，用以控制照明光束的直径。视场光阑的开大与缩小都会影响照射到被摄标本上的光束。开大视场光阑，光束直径超出孔径光阑，因光线过多，造成光线的乱反射，影响影像的清晰度和反差；缩小视场光阑，光束直径小于孔径光阑，视野亮度不足，影像不清晰，其四角将被切去。显微摄影时，视场光阑应开启到比取景框稍大的位置为好。

四、感光片的选用

显微摄影感光片的选择应根据标本的颜色和用途而定。一般情况下，对无色或单色标本，选用ISO 50～100的全色黑白胶卷。拍摄暗背景的标本（如免疫荧光染色标本），由于曝光时间长，可选用高感光度胶卷。拍摄彩色标本要用彩色胶卷。

显微照相要求有极好的色彩还原性、高分辨率和鲜艳的颜色反差，对于观察和拍摄普通组织切片使用的普通光学显微镜均为透射光明场照明，因此，不必使用感光度过高的胶卷，建议使用感光度为ISO 100或更低的胶卷。当拍摄暗场（相差、偏振光、荧光）时，曝光时间要增加。在多数情况下，选用高感光度胶卷。因为需要感光速度快，虽然影像颗粒大一些，但不会有很大的影响。

由于彩色胶片三原色感色层的结构原因，彩色胶片对摄影照明条件具有严格要求。拍摄彩色标本时，可选用的彩色胶卷分为日光型和灯光型两种，一般市售胶卷多为日光型。而日光型彩色片需要色温在5500～6500K，使用时必须加用色温滤色片校正，如加用升色温的平衡滤色镜（一般为蓝色），使钨丝灯光色温转换为太阳光的色温，才能将标本组织的颜色还原到接近原来的颜色。否则，照片会偏色。

同一个胶片厂生产的不同型号感光片彩色还原不同。同一个型号但不同批号、不同乳剂号的感光片，它们之间的彩色还原也有轻微的差别。当你开始彩色显微摄影时，最好进行试拍，找出最佳条件，然后再正式进行彩色摄影。

五、曝光补偿

高级显微摄影装置均有自动测光和自动曝光装置，只要正确输入胶片感光度一般能获得正确曝光。但如果一个视野中明亮面积过大（＞1/2），背景大部分为白色，而标本主体占视野面积过小（约为1/10～1/5）时，根据测光表或自动曝光装置进行拍摄会出现曝光不足的现象；反之，如视野中暗淡面积过大，背景大部分为黑色，被摄主体仅占1/10左右时，根据测光表或自动曝光装置进行拍摄会出现曝光过度。在这类极端情况下，为获得正确曝光，应根据测光表的曝光时间适当增加或减少曝光时间，进行曝光补偿，使标本主体得到正确表现。

在半自动显微摄影装置中，可以根据测光表给出的参数进行增减，如测光表给出的曝光时间是1/30秒，则在此基础上进行增减：增加一档曝光量为1/15秒，增加两档为1/8秒；减少一档为1/60秒，减少两档为1/125秒。全自动显微摄影装置的曝光控制器上，有一个曝光补偿旋钮，中间位置为0，即不需补偿的位置；向左旋转为亮视野补偿，即增加曝光量，分+0.5～+2.0档；向右旋转为暗视野补偿，即减少曝光量，分-0.5～-2.0档。

由于曝光补偿法是人为地增减曝光量，在正式拍摄前，应进行一些试拍摄，并冲洗出照片作比较分析，以确定正确的补偿量。

六、显微摄影的基本步骤

（一）显微镜的使用环境

1. 显微镜在观察和拍摄过程中，由于外界震动和人为走动，容易造成拍摄图像模糊，因此要远离震动源，并选用牢固、防震的桌子。

2. 从窗户射入的亮光会影响对焦的准确性，而如果室内光线太亮，也会使散射光进入目镜，影响观察。所以应将显微镜靠近墙边放置，使头顶上的照明光线微弱地射到显微镜的前面。

3. 将显微镜放在较清洁和干燥的环境中，平时用防尘罩盖上。另外，还要注意防潮、防霉。

（二）摄影前准备

1. 光路合轴调节

使光轴与光束处于同一轴线上。

2. 柯勒照明调节

使观察的视野获得均匀而又充分的照明；防止杂散光对照相系统产生影响；使被摄物不受热，影像清晰。

3. 物镜与目镜合理组合

依标本的不同和显微摄影要求，物镜与目镜的组合有一定规范。

4. 色温的设定

调节电压到照相的位置（约9V）；将中灰滤色镜（ND）、色温平衡滤色镜（NCB）放入光路中。

5. 瞳距及屈光度的调节

（1）放入标本，用10倍物镜对焦。

（2）调节光瞳间距，使左、右两个视场像合二为一。

（3）调节屈光度以适应观察者的视力，调节的方法随所用目镜不同而异。

6. 聚光镜调节中心

（1）用10倍物镜对焦后，把视场光阑关到最小。

（2）上下调节聚光镜，直至视场光阑像最清晰为止，使视场光阑成像在焦平面上。

（3）旋动二个聚光镜对中螺杆，将视场光阑像调到视场正中。

（4）放大视场光阑，使它与视场圆外切。如视场光阑调不出清晰的焦点，须检查标本载玻片的厚度，要求在0.9～1.2mm之间。

7. 观察时的调节

（1）将欲观察标本置于载物台上，使选用的物镜进入光路，并对标本对焦。

（2）调整聚光镜，并按上一步骤对视场光阑进行调节。

（3）将孔径光阑缩至物镜数值孔径的60%～80%。

8. 调焦和取景

（1）首先用10倍物镜对标本对焦，然后才可转动物镜转换器改换40倍、100倍等物镜；如果刚开始就使用高倍物镜，有可能损坏标本切片。

（2）显微摄影的调焦方法：既可通过摄影附件的聚焦望远镜调焦，也可以通过取景目镜进行。用细调焦螺旋调焦，改变物镜和被检物体的距离，使视野中物体影像的焦点聚于暗箱的焦平面上。

（3）当使用1倍到4倍物镜时，由于倍数越低、景深越大，对焦也越困难，在这种情况下，可使用调焦望远镜。

（4）从取景目镜中找到需要拍摄的景物，如果视野中的标本组织不适合构图，应调整景物方向，常用的方法是转动显微镜载物台或相机，使景物的方向与取景框相一致。

（三）显微照相的操作步骤

1. 根据不同标本，选用适合标本的胶卷进行拍摄，如胶卷从冰箱中取出，应使胶卷先恢复到室温再使用。

2. 打开照相机后机盖，装入胶卷，转片齿轮的齿牙必须确实地装入到胶卷的齿孔里。

3. 如使用自动卷片相机，则胶卷自动卷到第一张的位置，此时查看底片张数显示的数字是否为1，否则，说明底片未能卷上，需重复上一步骤。

4. 如为手动卷片，则按“Wind”键，此时查看倒片手柄是否转动，如转动，则胶卷已卷上，再按“Wind”键到第一张的位置，如不转动，则重复上一步骤。

5. 在自动曝光控制器上设定所选用胶卷的度数和补偿指数，并确定采用1%的中央点测光或30%的中央面测光。

6. 对标本对焦并调节视场光阑和孔径光阑，以取得合适的反差。视场光阑应略大于取景框。

7. 黑白摄影时，选用合适的滤色片以增加反差。加用滤色片的原则是凡要减弱某处颜色，就加与该颜色相同的滤色片；凡要加强某种颜色，就用与该颜色相反（相补）颜色的滤色片。

8. 调整曝光时间 最好的曝光时间是0.06～0.25秒。彩色摄影时，不要用改变电压来调节，而是用灰色滤光镜来调整时间，因为前者会使色温变化，而后者不影响色温。

9. 调整取景器的双十字，使之清晰，再对取景器中的标本对焦。

10. 按下快门键，曝光完毕以后，仔细听一下底片是否有转动的声音。

11. 记录  详细记录拍摄内容和各项拍摄参数。

七、特殊显微摄影技术

特殊显微摄影与普通显微摄影相比，除原理与方法基本相同外，还有需要特别注意的地方。

1. 荧光显微摄影特点

（1）由于荧光显微镜光源采用的高温高压汞灯和紫外光均对人体有害，必须选择安全和便于操作的显微镜进行操作和观察。

（2）不同的荧光标本必须选用正确的激发滤片才能观察到，所以，观察前必须了解制备荧光染色标本时所用荧光素的波长。

（3）拍摄时，对显微镜一般也采用“科勒照明法”进行调节，为增强反差，可尽量关小视场光阑，但注意不要令视场产生渐晕。曝光时一般采用1%点测光。

（4）建议拍摄时使用高感度胶卷，如ISO 400胶卷，但感光度更高的胶卷（指ISO值大于400的胶卷）其底片的颗粒会显得过于粗大，反差变小。

（5）荧光有衰退的特性，一般要有合适的防止措施。如染色后应及时观察，在拍摄和观察间隙，使用光闸阻止激发光对荧光标本的连续照射，防止荧光衰退。

2. 相差显微摄影特点

（1）视场光阑与聚光镜的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。

（2）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。

（3）切片不能太厚，一般以5～10μm为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。

3. 微分干涉相差显微摄影特点

（1）因微分干涉的灵敏度高，制片表面不能有污物和灰尘。

（2）具有双折射性的物质，不能达到微分干涉相差显微镜镜检的效果。

（3）倒置显微镜应用微分干涉时，不能用塑料培养皿。

八、显微照片放大倍数的计算

显微照片放大倍数的标注方法有两种：倍数表示法和比例尺表示法。

（一）倍数表示法

倍数表示法简单、清楚，但容易出现计算错误，使照片的放大倍数与实际数值相差甚远。最常见的错误是用观察倍数，即物镜与目镜倍数的乘积来表示显微照片的放大倍数，如用10倍目镜，用10倍、20倍或40倍物镜观察，将放大倍数表示为100×、200×或400×等。很显然，这与显微照片的实际放大倍数具有很大差异。出现这样的计算结果，一是忽略了摄影目镜的倍数，二是忽略了底片图像的放大倍数，三是忽略了照片放大尺寸与图像放大倍数之间的关系。另外，照片送到出版印刷部门，由于版面的需要，可能需将原照片放大或缩小，但实际上仍按原照片的放大倍数标注而未做相应的增加或减少。显微照片的放大倍数除了与物镜和摄影目镜的倍数有关外，还与底片的尺寸、印制照片的放大倍数及排版印刷的缩放大小有关，因此放大倍数的正确计算公式应是：照片长度/底片长度×底片图像放大倍数，底片图片放大倍数为摄影目镜倍数×物镜倍数×摄影目镜系数。其中，摄影目镜系数一般为1，但不同牌号的显微镜，配备不同型号的摄影目镜，其系数可能各不相同。由此可见，经此公式计算出来的显微照片的放大倍数很少会是整数。

（二）比例尺表示法

目前，有些出版单位对显微摄影图像的放大倍数已不用倍数表示法，而用比例尺表示法，即在照片上标注比例尺或标尺（scale bar）。比例尺表示法用来测量标本放大前的实际长度或直径，作者在撰写论文或排版人员在后期加工过程中，比例尺都会随之同步放大或缩小，因此，用比例尺表示放大倍数较用倍数表示法直接、客观、准确。

比例尺的大小通过计算照片长度与标本实际长度的比例获得。标本实际长度=底片长度/底片图像放大倍数。例如，照片中某一结构的长度为57mm（57 000μm），底片中相应结构的长度为11mm （11 000μm），底片图像放大倍数为100×（摄影目镜2.5×，物镜40×，摄影目镜系数为1），则标本中相应结构的实际长度为11 000/100= 110μm，该照片的放大倍数为57 000/110≈518.2或57 000/11 000× 100≈518.2。如将照片长度57 000μm看作是一把尺子，该尺子所代表的实际长度为110μm。把110μm标注于该尺子上，即得到该照片的比例尺。但由于此尺子太长，将如此长的尺子标在照片上，既不美观，也不便测量图像的细微结构，因此，须把尺子缩短，如将其缩短成1/5，即尺子长度为57/5=11.4mm，所代表的长度为110/5=22μm。为了便于使用这把尺子，可将尺子上标注的长度化为整数。数据扩大或缩小后，尺子也应按比例延长或缩短。例如，将22μm缩小为20μm或10μm，则比例尺的长度应缩小为11.4×20/22≈10.4mm或11.4×10/22≈5.2mm，即以10.4mm代表20μm或以5.2mm代表10μm。

数码显微摄影系统的软件中均带有内标功能，操作时根据物镜和摄影目镜的倍数进行设置，在拍摄出来的照片上则会自动显示出一定长度的标尺。

随着数码感光技术、数字信号储存技术的不断发展，数码摄影逐步应用到显微摄影领域。数码显微摄影是用数码相机代替传统的胶片照相机进行显微摄影的一种方法。与传统显微摄影相比，数码显微摄影具有以下优点：①可实时预览图像，拍摄后的照片保存在计算机内，可即时回看拍摄效果，不满意时可迅速重新拍摄，无废片现象；②拍摄后的照片在计算机上观察、浏览和分析，不需冲洗照片，既节省时间，还可解决实验的连续性问题；③保存在计算机的照片是数字化文件，可直接用图片处理软件进行编辑处理，其后期制作简单。

一、数码摄影基础

传统摄影是依靠感光胶片上银盐的光化学反应记录通过光学镜头的影像，而数码摄影是将通过光学镜头的影像信号转换为由计算机处理的数字信息，其记录影像不用传统的感光胶片，而是用光敏元件影像传感器来捕捉图像，并将捕捉的图像信号转换为数码信号存储在存储介质上，然后由计算机对其进行处理。

（一）影像传感器

影像传感器是一种包含几十万到几百万个感光组件的影像摄取元件，是数码相机最核心的部件之一。这种元件相当于传统相机的胶卷，能记录照射在它上面的光照强度、亮度及色彩，形成影像的模拟电流信号，再经模拟/数码转换处理后记录在影像存储介质上。目前，数码相机中主流的影像传感器为CCD，但是，另一种影像传感器CMOS也日益增多。

1. CCD

CCD是光电耦合元件（charge coupled device）的简称，是数码相机、扫描仪、数码摄像机等设备中可记录光线变化的一种半导体元器件，具有光电转换功能。

CCD成像原理：CCD是由数十万至数百万个微型光电二极管感光组件所构成的固态电子元件，由高感光度的半导体材料制成，通常排列成小面积的长方形，用于接受进入镜头的成像光线（图14-7A）。在CCD上每个微型光电二极管都能感受投射到它表面的光线强度，并将光信号转换为电信号，产生电荷。光越强，产生的电荷越多。拍摄曝光后，被摄物反射的不同明暗部位在CCD上产生不同强弱的电荷。这些电信号再经模/数转换成数码图像数据储存在相机中的储存媒介上。

CCD本身只是光电转换器，只能记录光线的强弱，无法分辨颜色。为了能记录影像的色彩，则在CCD表面加以彩色滤镜阵列，即将CCD制成微型镜头、分色滤色片和感光层三层。微型镜头能在不增加开口率的情况下增加感光面积，增加感光度。分色滤色片由三种单色滤色器构成，能把光线分解成不同的颜色；大部分数码相机的CCD采用红、绿、蓝三原色的单色滤光器，即采用加色法彩色合成原理来记录彩色影像，也有部分高档数码相机的CCD采用黄、品红、青三补色的单色光滤光器，即采用减色法彩色合成原理来记录彩色影像。感光层则将穿过滤色片的光线转换为电子信号，并将信号传送到影像处理器；不同颜色的光分别被感光基板感受和识别。

CCD的作用是将光信号转化成电信号，第一步就是要有足够的光信号，第二是在转化成电信号的时候要保证各个影像点的转化效率一致无噪声。而在进行荧光和化学发光拍摄时，往往得不到理想强度的光信号，这时候就要求对光子信号进行累积而得到足够强的光信号。作为一个光电转换装置，其内部和表面不可避免的含有杂质，由于热激发，杂质会产生电子，同样被电子阱捕获而成为电荷量，从而破坏其光电转换的效率，破坏产生的图像。这种由杂质产生的噪声称为暗电流噪声。而杂质热激发产生的电子数目与时间有关，因此在对弱光拍摄、对光子信号进行累积的时候，暗电流噪声就会很明显。如将CCD进行制冷让它工作在较低的温度中，可减少暗电流的产生，提高长时间弱光拍摄图像的信噪比。这种有制冷模块的CCD称为冷CCD。相比于普通CCD，冷CCD的暗电流更小，信噪比更高，能拍摄出理想的荧光或化学发光图像。

图7数码相机影像传感器

A.CCD；B.CMOS

2. CMOS

CMOS（complement metal-oxide semiconductor）即互补性氧化金属半导体，是计算机内一种重要的记忆芯片，用于保存计算机系统引导所需的大量资料。CMOS也可加工为数码相机中的感光器件（图7B），是一种颇有发展前途的影像传感器。CMOS主要利用硅和锗两种元素制成半导体，在光线照射时，通过互补效应产生电流。由此产生的电流可被处理芯片记录并解读成影像。CMOS集成度高，可以把电信号处理、模/数转换、放大电路、时钟驱动多种电路集成在单一芯片上，而这些电路在CCD数码相机上均为分离的芯片。因而，CMOS成本低，耗电少。CMOS的主要缺点，一是噪声较大，易在数码影像上引起杂点；二是敏感性较低，影响“ISO感光度”的提高。因此，CMOS不适于荧光或化学发光等弱光信号的拍摄。但是，运用高科技的降噪技术也能克服或减少CMOS的缺点，使其应用日趋广泛。

（二）影像传感器像素与面积

影像传感器（CCD或CMOS）上每一个光敏单元对应图像中的一个点，这个点即像素（pixel），是影像传感器形成影像信息的最小单位。不难理解，像素越高，对细节的展示越好，构成的影像清晰度也越高。如果想增加图像的清晰度，必须增加影像传感器的光敏单元的数量。数码相机的像素高低常用表示方法：①阵列表示法：即横、纵像素的乘积，例如，像素640×480，像素1024×768；②总量表示法：如像素100万，像素300万等。这两种表示方法的实质相同，只是前者的表示法比后者更精确，后者较前者更通俗。

影像传感器像素的多少决定数码相机的分辨率，因此通常被用于表示数码相机档次的主要依据之一。但是，影像传感器像素并不是衡量影像传感器质量的唯一标准，影像传感器本身的制造水平和其面积等性能对数码相机的影像质量也十分重要。

内插值是将影像传感器的像素总量通过某种软件进行一定程度的软化模糊处理，再在影像相同部位的空隙进行填充来增加像素。经内插处理后，影像传感器本身像素并没有改变，也不能从根本上提高影像的最终质量。例如，CCD本身像素300万，经“内插”标称像素总量达到500万。这种500万的内插值与本身具有500万像素的CCD质量不能等同。因此，在对像素总量的了解上，应注意是否有内插值，还是未经“内插”的值。

在数码摄影中，影像传感器替代胶卷起感光作用。胶卷的感光面积相对不变，如135胶卷是24mm×36mm，120胶卷是56mm×70mm。而影像传感器面积在不同的数码相机中变化较大。影像传感器面积常见的表示法有两种，一是采用长乘宽表示法，如18.4mm×27.6mm等，常用于高档专业型数码相机影像传感器面积的表示；二是采用面积的对角线长度表示，如2/3英寸、1/3英寸等，常用于普及型、业余型数码相机影像传感器面积的表示。对于影像传感器的面积不能按常规胶卷画幅对影像质量的正比关系来类比。常规胶片画幅越大，放大照片的质量越好。这是因为放大同样尺寸的照片，底片越大，放大的倍率越小的缘故。而影像传感器转存在储存媒介的数码影像质量是由影像传感器的像素来决定的。影像传感器的质量有优劣之分，在同等影像传感器质量的前提下，应将影像传感器面积与像素结合起来考虑所产生的影像质量，如在同等工艺技术前提下，像素相同，面积不同，其影像分辨率是相同的，但整体影像质量则是面积大的为好，因为面积大的CCD噪声较低，信号动态范围较广（影像层次过渡较平滑）。

（三）相当感光度

相当感光度是数码照相机中影像传感器感光的灵敏度，指相当传统胶卷的感光度，通常用等效于传统胶卷的感光度来标示。对传统相机来说，感光度是胶卷的性能。数码相机起感光作用的影像传感器是在相机上内置固定的，拍摄者在使用过程中不能随意更换，所以，影像传感器的感光度也是数码相机的主要性能之一。采用相当感光度而不直接采用感光度的概念，是因为数码相机中影像传感器感光度的概念并非完全指它对光线的敏感性能。拍摄时影像传感器产生的信号在进行模/数转换前需要进行放大，当提高数码相机感光度拍摄时，影像传感器输出的信号并未改变，只是改变了信号的放大倍率，实际上并未影响到影像传感器本身。

传统胶卷的影像质量（主要是清晰度和色彩还原）通常与感光度成反比，这种影响在数码相机上也类似，这是由于当提高感光度拍摄时，会引起更多的“噪声”。“噪声”增多是由于传感器的信号被放大时，干扰电流也被放大。“噪声”在画面上表现为杂点增多。

（四）白平衡

白平衡功能是一种针对不同光照环境的颜色纠正功能，也就是让白色物体在不同光照环境下依然呈现白色的功能。它的作用类似传统相机彩色摄影中校正色温滤光镜，用以获取准确的色彩还原。数码相机有自动、自定义和手动白平衡功能，自动白平衡对光线色温自动控制范围通常在2500～6500K之间，基本上能满足大多数拍摄场所的需要。如果现场色温超出上述范围时，利用手动白平衡功能便能有效解决这一问题。另外，还可以使用自定义白平衡，方法是在想要使用的光源下，将相机镜头对准白纸（或白色物体），通过相机相应调节按钮的操作，设定白平衡，以获得该光线下的色温平衡。这种调节适用于有经验的摄影者精细调整或特殊表现意图的调整。

（五）数码图片

数码图片是用数字记录影像的每个像素点的亮度、颜色等所形成的照片，也称像素映像。像素是构成数码图片的基本要素，每个像素都是光感受器感受光后产生的电流变化经过运算而转变成二进制素质的编码，这些编码代表一个像素点的亮度和颜色，每个点都由24位二进制数字表示这个点的色度、亮度等信息。

1. 数码图片的主要指标

表示数码图片的指标主要有图片大小和图像分辨率。

（1）图片大小：

图片大小可用两种方式表示：图像尺寸和图像文件大小。图像尺寸可用水平像素数×垂直像素数表示，如1024×768、1280×960等；也可用总像素数表示，如78.6万像素、122.88万像素等。图像文件大小即图片所占用的字节数，如1MB（1024字节）、4MB（4×1024字节）等。

（2）图像分辨率：

图像分辨率指图像中存储的信息量。表示数码图像的分辨率有三种方式：①图像总像素，常用图像宽和高度上像素的乘积表示，如640×480，总像素为30.72万个；②在图片尺寸固定情况下，分辨率可用单位长度的像素表示，通常用每英寸的像素数表示，以ppi（pixel per inch）为单位，如72ppi、300ppi等；③在印刷领域，常用单位长度上墨点的数量表示分辨率，即dpi（dot per inch），此时，图像分辨率实际上是指其输出分辨率。

2. 图像文件储存格式

在电脑的应用程序中，文件格式是指保存、输入各种数据时所采用的方式。影像文件格式定义了影像数据的储存方式，从而使其他应用程序能够识别和使用影像。由于不同的图像软件所能处理的文件格式不同，因此，常需要进行图像格式的转换。此外，同一幅图像也可以用不同的图像文件格式进行储存，但由于不同格式之间所包含的图像信息不完全相同，故文件大小也有很大差别。因此，摄影者在使用时应选择适当的图像文件格式。在图像储存格式中，与数码摄影直接相关的主要是JPEG、TIFF和RAW。

图像文件压缩形式有两类：一是无损压缩，即计算机程序将图像信息完整无损的还原出来，这类图像文件格式主要有TIFF和RAW等；二是有损压缩，即有损压缩通过计算保持画面中颜色变化部分的信息，但是，删除了图像中颜色突然变化部分的信息，这部分的信息通过观察时所产生的自然错觉来“填补”丢失的颜色信息，所以，仅靠肉眼难以辨别出被压缩数码图像在质量上的损失。有损压缩图像文件格式主要有JPEG等，其中JPEG格式是目前数码照相机最常用的图像文件格式，JPEG2000是2000年推出的JPEG升级版，它的可压缩比例比原先的JPEG提高约30%。同时支持有损压缩和无损压缩，原先的JPEG只能支持有损压缩。而无损压缩对高质量数码影像的获取具有重要的实用价值。

（六）存储媒介

数码相机的影像传感器把影像的光信号转变为电信号，再进而转变为数码信号记录在存储媒介上。数码相机的存储媒介有内置固定式和外置装卸式两类。内置固定式存储媒介安装在相机内部，用于临时存储图像，容量较小。外置式是数码相机存储媒介的主流，种类较多，不断有新产品开发。目前常用的有CF卡、SM卡、PC卡、MMC卡、SD卡和记忆棒等，每种均有其自己的特性。常用储存容量从数十MB至数G不等。显微数码相机拍摄的图像可直接储存在计算机硬盘上，硬盘储存容量可达数百G至数T。

二、数码显微摄影装置

显微数码摄影装置包括显微镜、CCD/CMOS专业数码相机、显微镜接口、数据传输线、计算机、图像采集处理软件等。专业显微摄影数码相机通过标准的C接口或F接口等适配器连接在显微镜上，用相应的数据线将相机的驱动接口与计算机相连（图8）。使用过程中，应用图像采集处理软件直接控制并采集图片，能同步进行图片的调整、选择、处理及存储。

图8显微摄影数码相机及其成像系统

三、数码显微摄影基本方法

进行数码显微摄影时，不仅要遵循一般显微摄影的基本要求，对显微镜进行调节（如普通显微摄影技术中的摄影前准备和特殊显微镜摄影操作要点），还需遵循数码摄影的基本原理来进行操作。不同品牌或型号的数码相机驱动软件不同，故进行数码显微摄影时操作方法各不相同，但其基本步骤相似。下面介绍应用高级数码显微摄影装置进行摄影的基本过程及注意事项。

（一）数码显微摄影操作步骤

将数码相机与显微镜及计算机连接并安装相应的驱动软件后即可进行数码显微摄影。

（1）开启显微镜、计算机和数码相机控制器电源（有些数码相机的控制器集成在计算机内，无独立电源），打开相机驱动软件。

（2）将拍摄拉杆或旋钮调节到目镜观察位置，镜下观察样品，选择拍摄区域（取景）。

（3）调节拍摄拉杆或旋钮，将影像转至数码相机。

（4）在计算机显示器上预览图像、取景。

（5）调节色彩，根据需要做手动白平衡，或者手动调节红色，绿色，蓝色的增益值。

（6）设定相当感光度。

（7）调节曝光时间。

（8）调节对比度。

（9）设定分辨率。

（10）聚焦后点击曝光（exposure）键或拍摄（capture）键，拍摄图像。

（11）选择图像保存格式与存储路径，保存图像并命名。

（二）数码显微摄影注意事项

数码显微图像的好坏与多种因素有关，如白平衡、照明亮度、相当感光度、曝光时间、分辨率、色彩模式、对比度、锐度等。在实际拍摄过程中，对这些参数都需要视样品情况、观察方式的不同，根据经验进行调整。

（1）白平衡调节：带有摄影装置的普通显微镜均装有内置青蓝色滤色镜，以提高色温，保持色温平衡。因此，在显微彩色摄影时，无需特殊调节白平衡，白平衡处于自动调节模式。如果不是灯光过强或过暗，此种模式均适用。但是，在光线过强或过暗超出自动调节白平衡范围的情况下，拍摄的照片偏蓝或偏黄，提示色温失衡，可通过调节光亮强度使色温平衡，或利用软件进行白平衡调整。在应用软件调整设定白平衡时，通常选择视野中灰白色背景区域或没有标本的空白区域（明场、相差、DIC）作为白色测量位置，取样方法有点取样或矩形框取样两种。拍摄荧光图像时，一般不需此操作；有些显微数码相机具有拍摄荧光图像的黑平衡功能，即以视野中黑色背景区域或无标本的空白区域作为黑色测量位置。

（2）相当感光度调节：多数数码相机的相当感光度既能自动调节，又能手动调节，多用手动调节。可调范围因数码相机不同而异。ISO自动调节时，视场光线明亮，相机则采用较低感光度拍摄；视场光线暗弱，相机则采用较高感光度拍摄。但这种自动调节幅度一般较小，在ISO 100左右。手动调节可在ISO 100、200、400、800、1600等之间。有的显微数码相机的相当感光度没有准确的ISO值，而是分为低、中、高或正常、高、最大三档。对数码相机相当感光度的选择使用原则与选择传统胶卷的感光度相同，即只要能满足拍摄需要，选低不选高。数码相机拍摄时采用的感光度越高，其数码噪声也越大，表现在影像上杂点越多。只有在使用低感光度无法拍摄时（如荧光显微镜下的拍摄），方选用高感光度。实际操作时，可根据屏幕上的实时预览图像亮度选择相当感光度。

（3）曝光时间选择：数码显微摄影多选用手动曝光模式精确控制曝光时间，最短时间可短至1/10 000秒，最长可达150秒或更长。通常将曝光时间控制在1/300～1/30秒之间，时间过短可导致曝光不足，过长会导致图像模糊。曝光时间可结合相当感光度调节和光亮度调节（选用不同灰色滤光镜），根据屏幕上的实时预览图像效果进行选择、设定。

（4）弱光图像的预览与拍摄：对亮度低、光较弱的图像（如荧光图像）的预览和拍摄，除了选择高感光度、延长曝光时间外，还可使用像素合并或叠加（binning）技术以避免过度提高感光度而增加噪点或过度延长曝光时间而使图像实时预览延迟。binning技术是将几个相邻的像素合并起来作为一个像素使用，这样可增加像素的大小和灵敏度，从而提高输出速度。观察、拍摄活体标本时也可应用binning技术。binning技术在有些数码显微摄影装置软件中称为快速捕捉（quick）模式。由于binning技术是将几个像素合并为1个像素，这样会减少整体像素，降低图像的分辨率，故一般仅在预览弱光或活动图像时选择binning或quick模式，而在拍摄弱光或活动图像时尽量选择高分辨率的非binning或精细（fine）模式。

（5）图像质量与存储格式选择：各种数码显微摄影装置对于拍摄图像质量均有若干可调种类。图像质量的选择包括对拍摄记录影像的分辨率、压缩比和清晰度等。一般应选择较高分辨率的TIFF非压缩图像格式和低压缩的JPEG格式。图像质量和存储格式还应根据拍摄目的来选择。如果拍摄后准备用于论文的照片，则宜用JPEG高质量拍摄模式，需打印的彩色照片尺寸越大，对像素的设定也应该越高；如果拍摄后准备用于出版图书，则宜选用TIFF非压缩图像格式。进行拍摄时，只要存储设备的容量能满足拍摄需要，尽可能采用高分辨率（高像素）、低压缩或不压缩格式。

（6）色彩模式及对比度、锐度、色阶、饱和度等参数调节：数码显微摄影软件有彩色、黑白、负片等色彩模式供选择，一般选择彩色模式进行拍摄，因为彩色模式能真实地记录所拍摄对象的色彩信息。当不需要彩色时，则选用黑白模式拍摄，可大量减少图像存储所需空间。

对比度、锐度、色阶和饱和度等对图像质量也有较大影响，因此，拍摄时除了选择色彩模式外，对这些参数也应适当调节。

（7）放大倍率和标尺的选择：专业数码显微摄影装置可以在捕捉图像时将标尺显示在图像上。用不同倍数的物镜拍摄到的图像放大倍率不同，其标尺比例也不相同，因此，在曝光之前要根据所使用物镜的放大倍率选择相应的标尺。